qPCR熒光定量

　　qPCR熒光定量是指在反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

　　qPCR熒光定量技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，具有特異性更強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，已成為*的核酸分子定量的標準方法，目前在基因表達研究和臨床疾病檢測等領域已得到廣泛應用（如轉基因動植物檢測、RNAi基因失活率檢測、病原微生物或病毒含量檢測、基因差異表達、基因分型）。

AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix

圖1.廣闊的定量閾

以HeLa 細胞cDNA 為稀釋液，將pUC19 質粒進行7 個10 倍梯度稀釋，第7 個稀釋梯度中質?？截悢禎舛燃s為7 copies/4 μl。使用AceQ® Universal 預混液對各稀釋梯度中的pUC19 質粒進行檢測，每孔模板使用量為4 μl?？梢钥吹?，AceQ®Universal預混液在寬廣的模板量區間內具有線性關系，可輕松檢測出個位數拷貝的待測模板。

圖2.產品的特異性

對隨機選取的38 個體系進行qPCR 檢測，驗證AceQ® Universal預混液擴增特異性。通過對融解曲線分析可知，38 個體系均無非特異性擴增。說明AceQ® Universal 預混液擁有的特異性。

圖3.全平臺通用

使用AceQ® Universal 預混液在不同類型的qPCR 儀（機型：StepOnePlusTM、QuantStudioTM 3、LightCycler® 96）上擴增GAPDH 基因，定量結果很好。說明AceQ® Universal 預混液儀器適用性廣，無需針對不同儀器調整ROX 濃度。

本產品是使用SYBR Green I 嵌合熒光法進行qPCR的試劑，采用化學法修飾的熱啟動DNA聚合酶AceTaq® DNA Polymerase，配合針對qPCR優化的適Buffer，可以有效抑制非特異擴增，從而顯著提高擴增效率，適用于進行高靈敏度的qPCR反應。本產品是一種含有qPCR反應適濃度SYBR Green I的2 × 預混試劑，可以在寬廣的定量區域內得到良好的標準曲線，對靶基因進行準確定量、檢測，重復性好，可信度高。另外，產品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye，適應于所有qPCR儀器，無需在不同儀器上調整ROX的濃度，只需在配制反應體系時加入引物和模板即可進行擴增。

Q1：如何判斷CT值有效性？

A1：(1) 融解曲線單峰（染料法）

(2) 擴增曲線指數擴增區域，復孔間CT值STD<0.2

(3) 閾值設置合理

(4) NTC確認無氣溶膠污染或可以忽略

(5) NRT確認無基因組殘留污染或可以忽略

(6) 擴增效率符合近似計算標準，標準曲線相關系數R2大于0.98，擴增效率e介于95-105%或者90-120%之間。

Q2：常見的擴增曲線異常有哪些，如何解決？

A2：(1) 擴增曲線不光滑：信號太弱，經系統矯正后產生。建議提高模板濃度重復實驗。

(2) 擴增曲線斷裂或下滑：一般由于模板濃度較高，基線的終點值大于CT值。建議減小基線終點（CT值-4），重新分析數據。

(3) 個別擴增曲線突然驟降：反應管內留有氣泡，由于溫度升高后氣泡破裂，使儀器檢測到的熒光值突然降低所致。建議反應前要仔細檢查反應管內是否有氣泡殘留。

(4) 擴增曲線呈鋸齒狀且不連續：ROX添加不當。需校正參比染料。

Q3：標準曲線擴增效率小于90%或者大于120%，線性關系不佳。

A3：(1) 加樣誤差。加大模板稀釋倍數，提高加樣體積。加大稀釋體積，使不同稀釋梯度的濃度更準確。

(2) 標準品降解。重新制備標準品，重復實驗。

(3) 模板濃度過高。存在反應抑制，增加模板稀釋倍數。

(4) 引物擴增特異性不好。重新設計引物，重復實驗。

Q4：在定量時，如何判斷cDNA投入量。

A4：*得到的cDNA需要進行多個梯度稀釋，將不同梯度稀釋的cDNA進行qPCR定量，選取CT值落在18-28，或者15-33范圍內的擴增曲線對應的cDNA 稀釋梯度作為后續該基因的參考稀釋度（CT值在18-28，或者15-33區間范圍被認為是準確的）。有一點需要注意，當使用cDNA原液進行檢測的時候，使用量不能超過 qPCR體系的1/10，因為cDNA中包含很多抑制qPCR的組份，使用體積過大會導致擴增失敗。

Q5：如何確定基因表達量高低。

A5：如果基因擴增CT值超過30，使用PCR產物通過梯度稀釋創建標準曲線，判斷該引物擴增效率，若擴增效率滿足90-120%，則可以判斷該基因擴增CT值偏大是由于基因表達量低所致。

Q6：陰性對照出現明顯擴增。

A6：(1) 反應體系污染。更換新的Mix、水、引物重復實驗。反應體系在超凈工作臺內配制，減少氣溶膠污染。

(2) 擴增為引物二聚體引起。配合融解曲線進行分析。

Q7：NRT出現明顯擴增。

A7：NRT出現明顯擴增，說明存在基因組污染，可通過實驗組和NRT的CT值來判斷實驗數據是否可用。當實驗組CT值與NRT的CT值差值大于5，說明由gDNA導致的誤差小于5%，則可以忽略gDNA污染；若實驗組與NRT的CT值差值小于3或者幾乎一致，則實驗組擴增產物的模板很大一部分來源于gDNA，這樣的實驗組就失去定量意義，建議使用去基因組的RNA提取試劑盒進行RNA提取，或者反轉錄時，加入去基因組步驟。

Q8：CT值出現太晚。

A8：(1) 擴增效率極低。優化反應條件，嘗試三步法擴增程序，或者重新設計合成引物。

(2) 模板濃度太低。減少稀釋度重復實驗，一般未知濃度的樣品先從Zui高濃度做起。

(3) 模板降解。重新制備模板，重復實驗。

(4) PCR產物太長。推薦PCR產物長度為80 bp-150 bp。

(5) 體系中存在PCR抑制劑。一般為模板帶入，加大模板稀釋倍數或者重新制備模板重復實驗。

Q9：反應結束無擴增曲線出現。

A9：(1) 反應循環數不夠。一般設置循環數為40，但需要注意的是過多的循環會增加過多的背景信號，降低數據可信度。

(2) 確認程序中是否設置了信號采集步驟。兩部法擴增程序一般將信號采集設置在退火延伸階段；三步法擴增程序應當將信號采集設置在72℃延伸階段。

(3) 確認引物是否降解。長時間未使用的引物應先通過PAGE電泳檢測完整性，以排除引物降解的可能性。

(4) 模板濃度太低。減少稀釋度重復實驗，一般未知濃度的樣品先從Zui高濃度做起。

(5) 模板降解。重新制備模板，重復實驗。

Q10：融解曲線出現多峰。

A10：(1) 引物設計不優。根據qPCR設計原則設計、合成新的引物。

(2) 引物濃度太高。適當降低引物濃度。

(3) cDNA模板帶有基因組污染。重新制備cDNA模板。

Q11：實驗重復性差。

A11：(1) 加樣體積失準。使用準確度較好的移液槍，擴大反應體積，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應體系中。

(2) 定量PCR儀不同位置溫度控制不一致。定期校準儀器。

(3) 模板濃度太低。模板濃度越稀，重復性越差，減少模板稀釋度或提高加樣體積。

(4) 做4-6個復孔，刪除其中重復性不好的孔，將剩余的進行后續計算。

Q12：高GC含量的模板，建議用什么產品進行定量？

A12：建議用Q111進行定量。

Q13：如果內參CT值很低，目標基因CT值很高，該如何稀釋樣品？

A13：可以在定量內參的時候將模板稀釋，而定量目的基因時模板不稀釋，結果仍舊采用 2-ΔΔCT進行計算，CT值減兩次，稀釋倍數會被相應減掉，但要保證不同樣品在檢測同一基因時稀釋倍數要一致。

Q14：如何預防氣溶膠污染？

A14：在加樣的時候要小心操作，盡量在超凈工作臺中進行加樣，并注意通風。擴增反應結束后，盡量不要打開產物的管蓋，不要跑膠，跑完后需要妥善處理。如果氣溶膠污染情況很嚴重，建議采用通風結合含強氧化劑的消毒液進行處理。

Q15：相對定量為什么要做標準曲線？

A15：相對定量分析中采用2-ΔΔCT公式進行計算比較不同樣品中基因的表達量時，前提是該體系的擴增效率e是盡可能接100%的。相對定量中做標準曲線的目的就是為了判斷該擴增體系中的擴增效率e是否是接近100%，能否用2-ΔΔCT公式進行計算；如果擴增效率e與100%相差很大，在比較基因表達差異時是需要帶入實際的擴增效率進行計算的。

Q16：怎么做定量？

A16：首先需要有一個已知拷貝數濃度的樣品作為標準品，將其稀釋至少5個梯度后和待測樣品同時上機進行定量檢測，以標準品拷貝數的Log值為橫坐標，以標準品的CT值為縱坐標繪制標準曲線方程，將檢測獲得的待測樣品的CT值帶入標準曲線方程中就能求得待測樣品的拷貝數濃度。

Q17：模板的稀釋液選擇。

A17：稀釋模板可以使用購買的Nuclease-free water、DEPC水或者實驗室自備的ddH2O等。TE里有EDTA會抑制酶的活性，不可作為稀釋液。