原創： niwanmao 流式中文網 昨天

線粒體是細胞代謝的重要介質，是活性氧（ROS）的產生者和靶點，是ATP水平和鈣穩態的調節劑，也是參與氨基酸、脂質和核苷酸合成的生物合成途徑的樞紐。

線粒體存在于所有細胞中，它們的大小、形狀和數量不同，這取決于細胞、基礎組織和其他一些因素的代謝需求?？紤]到它們在細胞和機體功能中的關鍵作用，在許多遺傳和非遺傳疾病以及癌癥和衰老中觀察到線粒體（mt）功能障礙并不奇怪。在絕大多數情況下，mt功能障礙的顯著特征包括mt膜電位（mtmP）、mt質量和氧化還原電位的變化。

流式細胞儀可以快速監測完整細胞中的所有這些參數，避免mt分離和/或破膜造成的假象?，F在已經有許多mt特異性熒光探針，可用于測量mtmP、mt質量和mt內ROS，見下表：

線粒體膜電位檢測原理和要點

mtmP是質子運動動力的主要組成部分，它是由mt基質泵到膜間空間的質子形成的。這種電位根據線粒體的狀態而變化，與它們合成ATP的能力有關，是細胞健康的常見指標。mt基質是負電位的，因此用于測量mtmP的染料通常是親脂性陽離子化合物，即帶正電荷的分子，它們可以跨膜而不會與膜結合，并與mtmP成正比地積聚在mt基質中。超極化線粒體能積聚更多的染料，而去極化線粒體積聚的染料較少。

通過流式細胞術評估mtmP時，必須考慮兩個要點：

首先，應仔細滴定染料濃度。高染料濃度會導致熒光猝滅，從而產生結果異常。雖然淬滅閾值因染料而異，但一般1–30 nM的濃度算足夠低，大多能避免不必要的淬滅現象。

其次，必須使用功能性對照來確保染料信號的變化能得到正確解讀，避免非特異性改變。合適的對照包括：

1.作為解偶聯劑的FCCP、CCCP和valinomycin，誘導去極化。2.oligomycin，一種ATP合成酶抑制劑，誘導去極化。3.nigericin，K＋/H＋離子載體，誘導超極化。

不同線粒體膜電位染料優缺點

DiOC6已廣泛用于流式細胞術研究中，但是，DiOC6作為NADH抑制劑的活性，以及對mt的毒性，強烈限制了該探針的使用。

與DiOC6相似，羅丹明123（Rh123）初用于不少研究，不過Rh123雖然容易進入細胞并迅速達到平衡，但不能很好地保留在里面。此外，在某些情況下，Rh123與線粒體的結合可能與線粒體能量狀態無關，這進一步限制了其使用。

四甲基若丹明乙酯（TMRE）和四甲基若丹明甲酯（TMRM）也被廣泛用于流式細胞術檢測mtmP，這些染料無毒，染色后不易淬滅，但應以相對較低的濃度使用，可以在染色后立即進行分析，無需洗滌。這兩種染料激發光均為488nm，發射波長574nm發射。通常，應準備未染色的樣品（也稱為“空白樣品”），以設置背景熒光的水平。因此，通過TMRE或TMRM分析mtmP的變化時，就被定義為給定樣品的MdFI的變化。

碳花青染料，尤其是JC-1被認為是檢測mtmP的可靠探針。JC-1具有多色熒光發射光譜，并允許對mt去極化進行比例式半定量評估。在單體狀態下，它發出綠色熒光（529 nm），而在高度依賴于mtmP的聚集狀態下，它發出橙紅色熒光（> 590 nm），在化合物誘導mtmP崩潰時，JC-1也會成為單體。這意味著，在健康細胞中，可以出現少量綠色，大多數為橙紅色熒光，線粒體去極化的細胞大多僅顯示綠色熒光?？紤]到由于mtmP變化引起的熒光變化，顯示結果的j方法是指示mtmP高或低的細胞百分比，而不是綠色和橙紅色熒光之間的比率。

自1993年以來，據報道，JC-1是幾種細胞類型和測定條件的可靠膜電位指示劑，并且其與其他熒光探針的兼容性也已在多色方案中得到了證明。但是，JC-1對過氧化氫敏感、光敏感以及單體與聚集體形式之間的平衡速度較慢，可能會在一定程度上限制其使用。其它類似于JC-1的還有JC-9和JC-10，JC-9的單體或聚集體形式在522 nm激發，分別以535或635 nm發射。JC-10在490 nm激發，并在520 nm（單體形式）或590 nm（聚集形式）發射。

線粒體質量檢測染料

線粒體質量可通過使用能夠結合特定mt成分的染料進行監測，而與mt極化狀態無關。因此，熒光量與mt含量成正比。Mito ID和nonyl acridine orange（NAO）這兩種染料能與mt內膜的cardiolipin結合，而MitoTracker染料與mt蛋白中存在的半胱氨酸殘基的巰基反應。其中一些染料，包括MitoTracker deep red 633，也與mt蛋白形成共價鍵，因此在細胞染色后可以固定。與TMRE和TMRM類似的是，對于MitoTracker染料，應測量MdFI的變化。

線粒體ROS檢測染料

關于mt ROS，近開發了兩種熒光探針，分別是MitoSOX和mi，以分別標記線粒體中的陰離子超氧化物和過氧化氫。

MitoSOX是氫乙啶化合物，可靶向定位到線粒體，依賴mtmP積累到線粒體中，氧化后與線粒體DNA結合后發出熒光。與其他探針類似，當使用MitoSOX和mi時，必須準備足夠的陽性和陰性對照全面驗證生物系統中mt H2O2的存在。Antimycin A或阿霉素是MitoSOX染色的j陽性對照，而外源H2O2則是mi的正確陽性對照。MitoSOX染色的陰性對照是細胞可滲透的超氧化物歧化酶模擬物或mt解偶聯劑，具體取決于細胞類型。對照的其它制備形式也可以用抗氧化劑來處理，例如N-乙酰半胱氨酸或其他能大大減少自由基產生的特異性清除劑。

目前已有不少文獻通過流式細胞術對MitoSOX和mi進行了測試，能選擇性定量角質形成細胞、內皮細胞、成纖維細胞和幾種癌細胞系中的mt陰離子超氧化物和mt過氧化氫，也有報道可能在同一細胞中同時使用MitoSOX和mi來分析活細胞中的mt ROS。